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		掌握配制培養(yǎng)基制備、滅菌與消毒的一般方法和步驟

　　實驗?zāi)康模?.了解培養(yǎng)基的配制原理；2.掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。

　　培養(yǎng)基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。

　　原則：目的明確 ;營養(yǎng)協(xié)調(diào);控制PH、滲透壓等條件;經(jīng)濟節(jié)約。

　　方法：查閱文獻;精心設(shè)計;試驗比較。

　　步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過濾、分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查。

　　培養(yǎng)基種類:

　　碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水。

　　一、按成份的不同劃分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基。

　　二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)劃分：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。

　　三、按培養(yǎng)基用途劃分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基。

　　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：

　　牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂15～20g，水1000mL，PH7.0～7.2(后調(diào))。

　　高氏1號培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：

　　可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。

　　查氏合成培養(yǎng)基：查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的培養(yǎng)基,其配方如下：

　　NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g,

　　MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然

　　麥芽汁培養(yǎng)基：用來培養(yǎng)酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60℃保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止,調(diào)整糖液濃度,煮沸后，過濾，調(diào)pH為6.0。

　　消毒與滅菌

　　消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體。

　　滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。

　　方法：

　　物理的方法：加熱、過濾、輻射

　　化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。

　　加熱法：

　　干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌

　　1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。

　　2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。

　　3、注意事項：

　　1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法；

　　2）溫度控制在<180°；

　　3）物品不能太擠；

　　4）溫度降至70°時才開箱門。

　　濕熱法：

　　原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。

　　高壓蒸汽滅菌法：

　　1、設(shè)備：高壓滅菌鍋

　　2、時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。

　　3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。

　　4、注意事項：

　　1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時方可打開。

　　在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見表2

　　壓力與溫度的關(guān)系表

　　常壓蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

　　煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10－15min。

　　超高溫殺菌：135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品滅菌。

　　優(yōu)點：保持食品價值和營養(yǎng)成分。

　　過濾除菌原理：介質(zhì)在有壓力時阻隔微生物。

　　適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。

　　設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。

　　優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。

　　注意事項：1、壓力適當(dāng)；2、無菌條件下進行；3、防止?jié)B透現(xiàn)象。

　　輻射滅菌原理：紫外線波長在200－300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強。此段波長易被細胞中核酸吸收；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強度和時間的乘積成正比。

　　缺點：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。

　　應(yīng)用：無菌室，醫(yī)院。

　　注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。

　　化學(xué)藥品滅菌原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細菌代謝機能。

　　殺菌劑如重金屬離子；抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。

　　注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。

　　常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸

　　福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等。

　　微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)

　　分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。

　　為什么要進行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。

　　常用的分離、純化方法：單細胞挑取法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法、平板劃線法。

　　稀釋涂布平板法：

　　步驟： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days。5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。

　　平板劃線法：

　　1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。

　　2、劃線方法

　　稀釋混合平板法：

　　1、先加菌

　　2、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度

　　3、混合均勻。

　　微生物培養(yǎng)技術(shù)

　　1、斜面接種

　　2、液體培養(yǎng)基接種

　　3、穿刺接種

　　將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

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