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| PCR和DNA序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù) | |||
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不同核糖體RNA 基因的PCR-RFLP分析只要內(nèi)切酶選擇合適，細菌分類中的作用不同。16SrDNA PCR-RFLP細菌分類中應(yīng)用最廣的快速分群方法。這一分析中。分析結(jié)果則與16SrDNA 序列分析結(jié)果具有很好的一致性。許多研究結(jié)果標明，16SrDNA PCR-RFLP指紋圖譜具有種的特異性，與數(shù)值分類和DNA 同源性分析同時使用，可較好地對細菌進行種水平的分類。23SrDNA 比16SrDNA 分子量大，包括更多的遺傳信息，但將其應(yīng)用于分類并不像16SrDNA 那樣普遍和成熟。Terefework等對不同種的根瘤菌菌株進行了23SrDNA PCR-RFLP和16SrDNA PCR-RFLP分析，兩種分析技術(shù)的結(jié)果具有較好的一致性，但對不同種發(fā)育地位的確定仍存在一定的差異，因此認為23SrDNA PCR-RFLP分析在細菌分類中的作用還無法做出最后的結(jié)論。16SrDNA 23SrDNA 基因的間隔區(qū)序列(intergenspaceIGS一種多拷貝的DNA 短片段，其長度和序列的變異水平大，將其擴增后用多位點內(nèi)切酶消化可得出種、亞種、生物型甚至菌株水平特異的DNA 指紋圖譜用于分類。IGS-RFLP分析比23SrDNA PCR-RFLP和16SrDNA PCR-RFLP分析更靈敏，近年來在細菌種及種以下水平的分類鑒定中應(yīng)用得越來越普遍。
rDNA PCR-RFLP分析不只具有PCR簡單快速、樣品用量少、可直接從細胞中擴增的特點。普通的實驗室中即可進行，同時防止了高貴的序列分析費用和放射性同位素的使用。因此這一方法已廣泛應(yīng)用于細菌的鑒定、分類和物種多樣性的研究中。
PCR-RFLP聚合酶鏈式反應(yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性分析的簡稱。PCR和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù)。該方法是通過 PCR擴增一段 DNA 片段。消化 PCR產(chǎn)物，然后再選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶。經(jīng)電泳，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達到鑒定不同基因型的目的
合成目的DNA 片段的新互補鏈。如此經(jīng)過n個周期，理論上擴增2n倍,可使目的DNA 片段得以迅速擴增。其主要步驟是將待擴增的模板DNA 置于高溫(約93℃-95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫(約50℃-70℃)下分別與目的DNA 片段兩側(cè)的互補序列復(fù)性結(jié)合；引物在DNA 聚合酶作用（約70℃-75℃）下沿模板按53方向延伸。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR模擬體內(nèi)DNA 復(fù)制條件在體外酶促合成特異DNA 片段的循環(huán)反應(yīng)。一般PCR經(jīng)30-40周期后可獲得百萬倍以上的目的DNA
聚合酶鏈式反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)（PCRRFLP分析技術(shù)是PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA 堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上。利用這一酶切性質(zhì)的改變，使酶切位點增加或者消失。PCR特異擴增包括堿基置換的這段DNA 經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCRRFLP可檢測某一致病基因已知的點突變，進行直接基因診斷，也可以此為遺傳標志進行連鎖分析進行間接基因診斷。
一般而言。用現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶酶解得到片段太多，細菌的基因組DNA 較大。且比較復(fù)雜，所以難以比較。但為了得到既簡單又具有足夠信息以計算不同菌株之間遺傳距離的電泳圖譜，人們將PCR技術(shù)與RFLP分析結(jié)合在一起，即利用PCR技術(shù)擴增普遍存在于細菌中的激進基因區(qū)域，再用特異的限制性內(nèi)切酶對得到特殊基因片段進行酶切、電泳和圖譜分析(PCR-RFLP分析)用于這一目的特殊基因主要是核糖體RNA 基因，即16SrDNA 23SrDNA 和16SrDNA 23SrDNA 基因的間隔區(qū)序列，此外根瘤菌的結(jié)瘤基因和固氮基因等也曾用于PCR-RFLP。
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