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| 了解培養基配制過程各環節的要求和注意事項 | |||
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一、目的要求
了解培養基的配制原理。
了解培養基常規配制程序。
二、基本原理
正確掌握培養基的配制方法是從事微生物學實驗工作的重要基礎，由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養微生物培養基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準備，培養基的配制與分裝，棉塞的制作，培養基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養基的無菌檢查等基本環節大致相向。
三、實驗材科
(一)藥品
待配各種培養的組成成分，瓊脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/l (升，統一用大寫)HCl溶液。
(二)儀器
天平或臺秤，高壓蒸汽滅菌鍋。
(三)玻璃器皿
移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養皿、玻璃漏斗等。
(四)其他物品
藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。
四、實驗內容
(一)玻璃器皿的洗滌和包裝
1．玻璃器皿的洗滌
玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶、試管、培養皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中，用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡。再用自來水及蒸餾水沖洗，洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。
2．滅菌前玻璃器皿的包裝
(1)培養皿的包裝 培養皿由一蓋—底組成一套。可用報紙將幾套培養皿包成一包，或者將幾套培養皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝后的培養皿須經滅菌之后才能使用。
(2)移液管的包裝 在移液管的上端塞入—小段棉花(勿用脫脂棉)。它的作用是避免外界及口中雜菌吹入管內，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左有。棉花自身長度約1-1．5cm。塞棉花時，可用一外圈拉直的曲別針，將少許棉花塞入管口內。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。
先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45度角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌(見圖5—1—1)。
(二)液體及固體培養基的配制過程
1．液體培養基配制
(1)稱量一般可用1/100粗天平稱量配制培養基所需的各種藥品。先按培養基配方計算各成分的用量，然后進行準確稱量。
(2)溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻棒攪動，加熱溶解。
(3)定容 待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養基中。
(4)調pH 一般用pH試紙測定培養基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養基偏酸或偏堿時，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液進行調節。調節pH時，應逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。
(5)過濾 用濾紙或多層紗布過濾培養基。一般無特殊要求時，此步可省去。
2．固體培養基的配制
配制固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1．5％-2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發而失去水分。
(三) 培養基的分裝
根據不同需要，可將己配好培養基分裝入試管或錐形瓶內，分裝時注意不要使培養基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，并將脫脂棉棄去。
1．試管的分裝
取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃管嘴，使培養基直接流入試管內(圖5—1—2)。
裝入試管培養基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養基可分裝至試管高度1／4左右為宜；如分裝固體或半固體培養基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養基的分裝量為管高1／5(約3—4m1)；半固體培養基分裝量為管高的1／3為宜。
2．錐形瓶的分裝
用于振蕩培養微生物用時，可在250 m1錐形瓶中加入50 ml的液體培養基，若用于制作平板培養基用時，可在250 m1錐形瓶中加入150ml培養基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。
(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎
為了培養好氣性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。
1．試管棉塞的制作
制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞(圖5—1—3)。
制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入。棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2／3在試管內，1／3在試管外(圖5—1—4)。
目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞。直接蓋在試管口上。滅菌待用。
將裝好培養基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管擁成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養基名稱及配制日期，滅菌待用。
2．錐形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用無菌培養容器封口膜直接蓋在瓶口，既保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便，故極受歡迎。
在裝好培養基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。
(五)培養基的滅菌
培養基經分裝包扎之后，應立即進行高壓蒸汽滅菌，100Pa滅菌20min（滅菌條件根據培養基不同有所差異，含糖培養基105℃，30min）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應暫存于冰箱中。
(六)斜面和平板的制作
1．斜面的制作
將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱置于木棒上，使成適當斜度，凝固后即成斜面(圖5—1—5)。斜面長度不超過試管長度1／2為宜。如制作半固體或固體深層培養基時，滅菌后則應垂直放置至冷凝。
2．平板的制作
將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養基融化后，待冷至50℃左右傾入無菌培養皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多，溫度低于50℃，培養基易于凝固而無法制作平板。
平板的制作應采用無菌操作，左手拿培養皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左于同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，月左手大拇指將培養皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入10-12m1的培養基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉平皿、使培養基均勻分布于整個平皿中、冷凝后即成平板(圖5—1—6)。
(七)培養基的無菌檢查
滅菌后的培養基，一般需進行無菌檢查。最好從中取出1-2管（瓶），置于37℃恒溫箱中培養1—2天，確定無菌后方可使用。
(八)無菌水的制備
在每個250 mL的錐形瓶內裝99mL的蒸餾水并塞上棉塞。在每支試管內裝4.5m1蒸餾水。塞上棉塞或蓋上塑料試管蓋。再在棉塞上包上一張牛皮紙。高壓蒸汽滅菌，100 Pa滅菌20分鐘。
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