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微生物菌種樣品的處理和稀釋方法 | |||
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1.操縱方法:以無菌操縱取檢樣25g(或25ml),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)目的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加進(jìn)稀釋液后,最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成1:10的均勻稀釋液。
用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁漸漸注進(jìn)含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液。
另取1ml滅菌吸管,按上項(xiàng)操縱順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2.無菌操縱:操縱中必須有“無菌操縱”的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的,不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等用具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品假如有包裝,應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。
操縱應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺(tái)暴露15分鐘,每個(gè)平板不得超過15個(gè)菌落。
3.采樣的代表性:如系固體樣品,取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn),宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨,液體樣品須經(jīng)過振搖,以獲得均勻稀釋液。
4.樣品稀釋誤差:為減少樣品稀釋誤差,在連續(xù)遞次稀釋時(shí),每一稀釋液應(yīng)充分振搖,使其均勻,同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。
在進(jìn)行連續(xù)稀釋時(shí),應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流進(jìn),勿使吸管尖端伸進(jìn)稀釋液內(nèi),以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。
為減少稀釋誤差,SN標(biāo)準(zhǔn)采用取10mL稀釋液,注進(jìn)90mL緩沖液中。
5.稀釋液:樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對(duì)含鹽量較高的食品(如醬油)進(jìn)行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。
?。ǘ﹥A注培養(yǎng)
1.操縱方法:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì),選擇2~3個(gè)適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí),以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。
將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注進(jìn)平皿約15ml,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿,混合均勻。同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾進(jìn)加有1ml稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內(nèi)作空缺對(duì)照。
待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h,取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目,乘以稀釋倍數(shù),即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數(shù)。
2.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫,溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長,過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴,應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,從12~20ml不等,一般以15ml較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時(shí),培基底部如有沉淀物,應(yīng)將底部棄往,以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。
3.為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加進(jìn)平皿后,應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻,可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn),檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min,以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。。
4.培養(yǎng)溫度一般為37℃(水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度,由于其生活環(huán)境水溫較低,故多采用30℃)。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h,有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,瓊脂平板培養(yǎng)48h后,培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15%。
5.為了避免食品中的微小顆?;蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,不易分辨,可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板,不經(jīng)培養(yǎng),而于4℃環(huán)境中放置,以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。
在某些場(chǎng)合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養(yǎng)瓊脂中加進(jìn)氯化三苯四氮唑(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色,易于分別。 |
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