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| Southern雜交對于高分子量的DNA的作用 | |||
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Southern雜交對于高分子量的DNA 如高等生物的細胞核DNA 酶切后很難用電泳分開。單純用酶切圖譜很難說清，往往染出連續一片。另外對于酶切后大小相似的片段其核酸序列是否相似。Southern發明膜上原位DNA 雜交后，使多態性分析更為精確和完善，因此進行RFLP分析研究時，現在都需要進行Southern雜交。典型的方法是DNA 酶切產物用瓊脂糖電泳分離后，把膠反過來放在濾紙上，膠的上方放一張同樣大小的硝酸纖維素膜，再鋪濾紙和吸水紙，并加一重物，膠下的濾紙浸在NaCl檸檬酸鈉溶液中，借毛細管原理，溶液不時通過膠進入上面的吸水紙層，DNA 隨溶液從原位轉到硝酸纖維素膜上，這就是毛細管轉移法。另外還可通過電轉移或真空轉移法將DNA 片段轉移至纖維素膜上。轉移好的硝酸纖維素膜經80℃烘烤2小時，將DNA 片段固定于膜上，用放射性同位素標志的探針與膜一起保溫，復性條件下，凡與探針同源的膜上固定的DNA 就能結合上探針，洗去沒有結合的探針，放射自顯影就顯示出與探針同源的DNA 片段。簡單地講其過程包括 ⑴ DNA 純化和酶切；⑵ 酶切片段 電泳分離和轉移；⑶ 標志雜交探針；⑷ 膜上DNA 雜交；⑸ 同源片段的顯示。
現在許多實驗室在轉移時使用尼龍膜。不易碎，據稱這種膜機械性能好。可以反復使用，即用一個探針雜交顯示RFLP后，可以洗去探針，用另一個探針和膜上的DNA 再雜交，如此重復3-5次，得到數個RFLP另外尼龍膜上的DNA 固定可以用120℃半小時或紫外線照射幾分鐘，節省了時間，還可以在堿性條件下直接轉移DNA
導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）DNA 水平的差異（即多態性）多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA 克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark構建分子圖譜。限制性片段長度多態性（RFLPRestrictFragmentLengthPolymorphRFLP技術于1980年由人類遺傳學家Bostein提出。第一代DNA 分子標志技術。DoniKel利用此技術于1987年構建成第一張人的遺傳圖譜。DNA 分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLPRestrictFragmentLengthPolymorphism,或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失。限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變。
即表示目標基因與分子標志之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標志克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA 后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標志組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,標明這個性狀（基因）與分子標志連鎖。分子標志與性狀之間交換值的大小。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標志協同分離時。EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標志則有幾個甚至上千個。分子標志越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。
RFLP分析是集限制性內切酶、核酸電泳、印跡技術、探針雜交等技術于一體的綜合應用。其原理如下：每一限制性核酸內切酶在切割DNA 分子時都有固定的切點序列，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。DNA 分子中核苷酸排列順序的變化有可能使該切點丟失或增加。由于不同生物群體的DNA 序列千差萬別，因而用同一限制性內切酶消化后，所得DNA 片段的長度分布也是千變萬化的這種酶切片段長度分布的多樣性就稱為限制性片段長度多態性(RestrictFragmentLengthPolymorphRFLP其常用于生物群體的遺傳分析。
然后在瓊脂糖凝膠上電泳分離后對所得圖譜進行分析比較得出分類結論，以顯示不同種群基因組DNA 限制性片段長度多態性。RFLP發生的指紋圖譜更適用于細菌種間及種內株間的分型鑒定。RFLP可以對大量的DNA 樣品進行有效的分析，同時，對mtDNA 線粒體DNA 分折對種內或種問的分類會更靈敏。此外，核糖體rRNA 分析也已應用于真菌種間和種下的親緣關系。限制性片段長度多態性(restrictiongfragmentlengthpolymorphism,最初用于有性繁殖后代的分離以構建遺傳圖(Botsteiet1980也是第一代以DNA 指紋圖譜為基礎用于環境微生物分型鑒定的方法。其原理是利用適當的限制性內切酶在特定位點上將細胞基因組DNA 切割成不同長度的片段。RFLP分析。 |
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