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| RFLP探針來源于構建的DNA 質(zhì)粒文庫 | |||
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RFLP探針來源于構建的DNA 質(zhì)粒文庫，對于探針的來源。但也有人用PCR方法直接擴增DNA 特定序列作為探針。探針的標志主要有兩大類，一是用同位素標志，如32P和35S等，早期的RFLP分析就是采用同位素標志探針檢測多態(tài)性，但這種標志存在一些缺點如半衰期短，標志的DNA 不宜保管以及環(huán)境污染等問題。另一類是非同位素標志法，這類方法是許多實驗室經(jīng)常采用的方法，如生物素標記法，最簡便的用PCR反應直接將生物素化－11dUTP作為局部底物合成DNA 鏈，這種產(chǎn)物便可作為核酸探針。另外還有地高辛(Digoxigenin標志法，辣根過氧化物酶標記法等。
主要是利用腺病毒連鎖的溫度敏感性突變對特定的限制性片段長度的差異把這一突變定位到限制性片段的物理圖譜上。Zuerner等在研究腎臟鉤端螺旋體分型時，RFLP最早于1974年作為一種工具用于遺傳研究。采用RFLP技術幾乎可將腎臟鉤體型內(nèi)各血清亞型區(qū)分進去，即在限制性內(nèi)切酶切分析的基礎上再進行Southern雜交，但單獨使用限制性內(nèi)切酶分析則不能全部區(qū)分出各血清亞型，四株酶切圖譜相似的血清株中，用Southern雜交則能逐一加以區(qū)別。Torpstra等和Thiermann等也同時指出單獨使用限制性內(nèi)切酶分析也難以區(qū)分具有類似酶切圖譜的鉤體血清亞型。因此輔以核酸雜交的RFLP分析對腎臟鉤端螺旋體的流行病學研究及分型鑒別具有重要的實用意義。
除了RELP分析外，擴增片段長度多態(tài)性分析 目前。還開發(fā)了DNA 擴增片段長度多態(tài)性分析，使DNA 片段多態(tài)性分析技術更為快速和完善。
人們就從已知是多態(tài)性的DNA 序列動身，擴增片段長度多態(tài)性(AmplificFragmentLengthPolymorphAFLP聚合酶鏈反應(PCR基礎上進行的一種核酸分析方法。PCR發(fā)明不久。設計一對引物進行擴增，然后用瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色檢查擴增產(chǎn)物在數(shù)目和分子量大小上的變化，這種方法與RFLP不同的以擴增代替了酶切，其優(yōu)點是防止了RFLP煩瑣的DNA 酶切、轉(zhuǎn)移和雜交等步驟，而且只需要很少量的模板DNA 缺點是必需事先了解位點的序列，這種AFLP又稱為專一擴增多態(tài)性(SpecifAmplifiPolymorphSA P如Jefferei等(1988根據(jù)人小衛(wèi)星DNA 序列，設計引物進行人 DNA 基因擴增，得到高多態(tài)性的小衛(wèi)星擴增圖譜，大大減少了模板DNA 需要量。
即將DNA 特定序列用PCR方法擴增，聚合酶鏈反應/限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR/RFLP目前有些研究者將PCR和RFLP結(jié)合起來對DNA 進行研究。其擴增產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶進行酶切分析。朱沛軒等采用PCR/RFLP方法對100株B群腦炎奈瑟氏菌進行分型研究，根據(jù)這類細菌的1類外膜蛋白基因(PorA 設計引物并擴增，受試菌株均擴增出 116bP片段，以限制性酶MspI消化發(fā)生6-8條酶切片段，通過對這些片段的長度和數(shù)量的分析，結(jié)果將受試的100株細菌分為33種RFLP型(B1-B33其中B20型內(nèi)的菌株數(shù)量最多 占31％)且多有致病性(29/31與非致病性的B21B22酶切圖譜中只有個別小片段位置差別，反映出基因突變后一個切點移位導致酶切圖譜的微小變化。這種方法分辨率高、重復性好、簡單快速。張曉峰等使用PCR/RFLP方法對康氏立克茨氏體的基因型進行了分析，根據(jù)立克茨氏體190KD蛋白基因序列設計一對引物并用于擴增來自南非、埃塞俄比亞、摩洛哥、印度及俄羅斯等地的七株立克茨氏體、擴增結(jié)果出現(xiàn)三種不同分子量大小的片段，標明這三類菌株的擴增基因中核苷酸排列相互不同；擴增產(chǎn)物用限制性酶Rsal及Pstl酶切則可得到四種不同的RFLP圖譜，進一步標明康氏立克茨氏體各株間基因型存在著差異。
從而進行多態(tài)性分析。與特異性引物擴增有幾個不同點：⑴ 特異性引物根據(jù)多態(tài)位點DNA 序列設計，3.隨機擴增多態(tài)DNA RA PD隨機擴增多態(tài)DNA RandomAmplifiPolymorphDNA 用單個或單個以上的隨機引物擴增DNA 發(fā)生長度不等的片段。一般成對使用各長20bP左右的引物，RA PD引物則完全隨機，長度不等，多為8-10bp一般為單個使用，G＋C含量一般在50％以上；⑵ 特異性引物擴增退火溫度較高，堿基配對要求嚴格，RA PD退火溫度較低多為 35-36℃，允許適當?shù)膲A基錯配，從而引發(fā)更多的擴增子(Amplicon增加監(jiān)測多態(tài)性的能力。RA PD引物的序列完全隨機，幾乎可以用于任何生物而揭示其整個基因組的多態(tài)性，因此得到廣泛應用。孔繁榮等在淋球菌菌種鑒定及分型研究中采用RA PD技術用隨機引物對淋球苗WⅠ、WⅡ、WⅢ三群的基因組DNA 進行擴增、三群細菌均表示出共有的特征性條帶以及各群特有的條帶，標明三群淋球菌的基因組同源性很高，表示型”上的共性占主導地位，另一方面也說明了三群細菌在基因組DNA 中存在一定差別，因此根據(jù)這種多態(tài)性可對細菌進行分類和鑒定。Feket等采用5個不同的隨機引物單獨或成雙使用對25株不同的布氐桿菌進行隨機引物擴增性片段長度多態(tài)性研究。對未知DNA 序列的布氏桿菌采用隨機引物擴增，結(jié)果顯示在同等擴增條件下，不同的布氏桿菌表示出不同的基因類型，因此根據(jù)擴增產(chǎn)生的片段長度多態(tài)性可檢測診斷特異性菌株，解布氏桿菌間的基因關系，計算相似系數(shù)等。 |
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