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| 溴化氰活化法是常用的活化方法 | |||
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溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨基（NH2）反應，主要生成異脲衍生物。
溴化氰活化的基質可以在溫和的條件下與配體結合，結合的配體量大。利用溴化氰活化的基質通過進一步處理還可以得到很多其它的衍生物。這種方法的缺點是溴化氰活化法的基質和配體偶聯后生成的異脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質與配體結合不夠穩定，尤其是當與小配體結合時，可能會出現配體脫落現象。另外溴化氰有劇毒、易揮發，所以操作不便。
溴化氰活化瓊脂糖用于配體固相化是實驗室親和層析最常用的技術之一，該方法簡便廉價，并廣泛應用于蛋白質、核酸、凝集素等。下面以此為例介紹親和層析的實驗方法：
試劑與配制
1.Sepharose 4B
2.CNBr（劇毒）
3.抗原或抗體
4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5.0.1Mol/L NaHCO3
6.2Mol/L NaOH
7.0.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml ?0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml ??NaCl32.76g 加水至4 000ml。
3.8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl84ml加水166ml共500ml。
3.9．7Mol/L尿素
3.10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl?? 2.93g 加水至500.00ml。
瓊脂糖活化
1.取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。
2.在通風櫥內稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應10min。在1min~2min迅速調整pH為8.0～11.0維持10min。
3.將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
4.偶聯蛋白20ml 4B液體相當于一半的固相載體。事先將需偶聯的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數小時(一般偶聯量為10~30mg/g載體)。
5.將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內，從抽洗到偶聯），4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結合。
6.在燒結玻璃漏斗中用200ml偶聯緩沖液（0.1mol/L碳酸氫鈉，0.5mol/L氯化鈉，pH8.3）洗偶聯介質一次。
7.轉移偶聯介質至含100ml阻斷緩沖液（1mol/L乙醇胺，鹽酸調pH至8.0）的燒瓶內，室溫孵育2h或者4℃過夜。
8.在燒結漏斗中依次用100ml偶聯緩沖液100乙酸鹽緩沖液（0.1mol/L乙酸鈉，0.5mol/L氯化鈉，pH4.0）洗偶聯介質一次，重復此步驟四次。
9.如果不準備立即使用偶聯介質，影使用含0.02%疊氮鈉的偶聯緩沖液再洗一次。
裝柱
1.選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯蛋白的瓊脂糖約30ml。
2.裝柱：將已與蛋白偶聯的瓊脂糖裝入層析柱內，擰緊下口夾，讓其下沉，數分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。
3.洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。收集全部的洗脫液，測得的OD280值×洗脫液的總ml數即為未偶聯蛋白的含量，由此可計算偶聯率。 |
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