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| 常用的一些測定蛋白質分子量的幾種方法介紹 | |||
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1．凝膠過濾法
凝膠過濾法分離蛋白質的原理是根據蛋白質分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內，分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標準，進行凝膠層析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行凝膠層析，根據其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量。
2．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法
蛋白質在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質變性并解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS后，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的強負電荷，并且使蛋白質分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決于蛋白質分子量的大小，蛋白質分子在電泳中的相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標準蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據所測樣品的相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子質量。
3．沉降法（超速離心法）
沉降系數（S）是指單位離心場強度溶質的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時，由于比重關系，蛋白質分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數，將S帶入公式，即可計算出蛋白質的分子質量。
一般的方法：
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量
[原理]
十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實驗基礎上發展起來的一項新技術。用這種方法測定蛋白質的分子量具有快速靈便，設備簡單等優點。
蛋白質的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大多數蛋白質，主要取決于它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無關。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質氫鍵和疏水鍵，并按比例地結合到這些蛋白質分子上形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，每克蛋白質一般結合1.4克SDS。SDS與蛋白質的定比結合使蛋白質-SDS復合物均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過蛋白質原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質間原有的電荷差異。在水溶液中，蛋白質-SDS復合物具有相同的構象，近似雪茄煙形的長橢園棒（短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化），克服了蛋白質間原有的形狀差異。這樣蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質分子量的函數。蛋白質分子量與電泳遷移率間的關系可用下式表示：
lgMr = K – bm
式中 Mr為分子量；K為常數；b為斜率；m為遷移率。
因此，用本法測定蛋白質的分子量只需根據待測蛋白質在已知分子量的標準蛋白質的lgMr～遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。
用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質外，均不是天然蛋白質的完整分子量，而是組成這些蛋白質的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構象異常，或帶有大輔基的蛋白質不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。對一些結構蛋白如膠原蛋白等也不適用。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續系統電泳和 SDS-不連續系統電泳兩類；按照所制成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類。 |
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