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| 實驗大腸桿菌的對照培養分離及菌種保存方法 | |||
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大腸桿菌(Escherichia coli)是分子遺傳學實驗、基因工程操作中廣泛采用的一種受體菌，是Escherich在1885年發現的，在相當長的一段時間內，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜（禽），常引起嚴重腹瀉和敗血癥，它是一種普通的原核生物，根據不同的生物學特性將致病性大腸桿菌分為5類：致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌屬于細菌。它的遺傳背景研究的比較詳細，常用做寄主進行基因擴增及外源基因的表達。
一. 實驗目的 : 掌握大腸桿菌的對照培養、單菌落的分離及菌種保存方法。
二. 實驗原理 : 大腸桿菌除本身的核染色體外，往往還含有質粒(Plasmid)DNA，這是一種雙鏈閉合環狀的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常質粒DNA帶有利于細菌在某一特定環境下生存的酶的基因，而使寄主菌表現以下一些表現型:
1．對抗生素的抗性 2．產生抗生素 3．降解有機復合物
4．產生大腸桿菌素 5．產生內毒素 6．產生限制修飾酶
pUC19質粒上帶有一個與大腸桿菌抗氨芐青霉素(Ampecillin)有關的基因，它能編碼一種β-內酰胺酶，這種酶降解氨芐青霉素，從而消除了抗生素對細胞壁形成的抑制作用，不含這種質粒的細菌則不能在含抗生素的培養基上存活。
三．實驗材料 : E．coli InvaF' E．coli InvaF' (pUC19)
四．實驗儀器 、器皿及試劑:儀器 : 超凈工作臺 恒溫培養箱 高壓滅菌鍋 恒溫水浴鍋 微波爐等。器皿: (見附錄)
試劑 : 瓊脂 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl 氨芐青霉素 NaOH等
五．實驗步驟 :
1. 配制培養基：
ａ．LB(Lurib-Bertani) media
酵母抽提物 (Yeast extract) 5g/L
胰蛋白胨 (trytone) 10g/L
Nacl 10g/L
加蒸餾 水定容至1000ml調節pH值至7.0。配制750ml固體培養基: 在上述液體培養基中，按15 g/L加入瓊脂 加熱至充分熔化，即成固體培養基。ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH2 O至100ml。將上述培養基和丙三醇溶液高溫蒸汽消毒15磅20min
2. 倒平板:將固體培養基加熱至充分熔化，待溫度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml搖動混勻，每平皿倒入25ml左右，此過程應進行無菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。3. 待培養基凝固以后，用接種環(灼燒消毒后)分別接種各一環貯存菌種 :E.coli InvaF' 和 E.coli InvaF' (pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,劃線接種要防止劃破培養基，劃線方法如圖所示:
第一次劃線后接種環灼燒 第二次劃線起點與第一次 如此在平板上
再進行第二次劃線 劃線交*，接種環灼燒后再
進行第三次劃線
4. 接種完成后將培養皿倒置入培養箱37℃培養過夜，運用這種劃線方法接種，可以較好地保證單菌落的形成。5. 比較兩菌系在培養基上的不同反應。挑取:E.coli InvaF' E.coli InvaF' (pUC19)的單菌落分別接種至含Amp和不含Amp的5ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。6. 分別吸取0．5 ml菌液在無菌條件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一滅菌的凍干管中，混勻至-20℃保存。
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